Comprar antihongos 71

+

Antifúngico pruebas de sensibilidad Ahora es posible para el laboratorio de microbiología clínica para realizar fiable en las pruebas de susceptibilidad antifúngica in vitro en una amplia gama de levaduras y mohos. El objetivo de este artículo es proporcionar una revisión de lo que está actualmente disponible para el laboratorio clínico junto con algunos comentarios prácticos sobre las pruebas de sensibilidad antifúngica. Los grandes avances con la normalización y la interpretación clínica de las pruebas de sensibilidad antifúngica in vitro se han realizado en los últimos años. Estos incluyen la introducción de métodos de referencia estándar para las levaduras y mohos por theCLSI (1,2,3) y la publicación de puntos de quiebre interpretativos, especialmente para fluconazol e itraconazol contra las infecciones por Candida (4). En el mundo de las pruebas de sensibilidad antifúngica, el CLSI ha establecido la metodología de referencia, proporcionando probados estándares de laboratorio, reproducibles, el consenso de revisión por pares que se actualizan de forma regular. Para hacer pruebas de sensibilidad antifúngica que tendrá que comprar las normas pertinentes del CLSI y manchas de control de calidad. estándar CLSI M27-A2 para levaduras: Ver CLSI. Método de referencia para la dilución de caldo antifúngica pruebas de sensibilidad Las levaduras; El estándar de aprobación-Segunda edición. documento CLSI M27-A2. CLSI, Pennsylvania, EE. UU. 2002. El estándar M27-A2 es para prueba levaduras incluyendo especies de Candida y Cryptococcus neoformans (C. y C. gattii), ya sea mediante el uso de un sistema de prueba de dilución en caldo macro o micro. Se recomienda el uso de medio RPMI-1640 (con glutamina y rojo de fenol, sin bicarbonato) (Sigma # R-7755 St. Louis, EE. UU.) suplementado con 0,2% de glucosa y tamponada a un pH de 7,0 con 0,165 mol / L de MOPS ( 3- [N-morfolino] propanosulfónico) (Sigma # M-6270), el inóculo estandarizado a 0,5 McFarland utilizando un densitómetro y la incubación a 35 ° C. Es fundamental el uso de los reactivos exactas que se indican en Sigma. Las placas se leyeron a las 24 horas para las levaduras no delicados como Candida o al de 48 a 72 horas para los más lentos levaduras que crecen como Cryptococcus. Los pocillos de microdilución deben ser visualizados con la ayuda de un espejo de lectura y el crecimiento en cada pocillo debe compararse con la del control del crecimiento. Una puntuación numérica de 0 a 4 se le da a cada pocillo utilizando la siguiente escala: 0 = ópticamente transparente, 1 = ligeramente turbia, 2 = prominente reducción de la turbidez en comparación con la del control de crecimiento libre de drogas, 3 = ligera reducción en la turbidez en comparación con la del control de crecimiento libre de drogas, 4 = ninguna reducción de la turbidez en comparación con la del control de crecimiento libre de drogas. El MIC para la anfotericina B es la concentración más baja, con una puntuación de 0 (ópticamente transparente). Las CIM para los azoles y 5FC son las concentraciones más bajas con una puntuación de 2 (disminución importante en la turbidez). Interpretación de los resultados: Para la mayor parte de los PRM anfotericina B para las especies de Candida clúster entre 0,25 y 1,0 ug / ml. Sin embargo hay que destacar que el método M27 no permite sistemáticamente la detección de cepas resistentes y la aísla con CIM de 1,0 ug / ml deben considerarse probable que sea resistente. Medio con antibióticos 3 suplementado con 2% de glucosa puede permitir una detección más fiable de resistencia, pero este medio no ha sido estandarizada y sustancial variabilidad de lote a lote es posible. En lo positivo, los puntos de interrupción de interpretación para Candida contra el fluconazol, itraconazol y 5-fluorocitosina se han establecido (tabla 1). Estos puntos de corte se han utilizado también para aislamientos de Cryptococcus donde también hay alguna correlación entre MIC elevada y failure1,5 tratamiento. Arrastrando los puntos finales. Algunos azoles, particularmente fluconazol, exhiben un fenómeno conocido como arrastre. Trailing se produce cuando la turbidez disminuye continuamente a medida que aumenta la concentración de fármaco pero la suspensión no ser ópticamente transparente (inhibición parcial del crecimiento a través de una amplia gama de concentraciones antifúngicos). Para la mayoría de los aislamientos, la diferencia entre la lectura a las 24 horas frente a 48 horas es mínima y no alterará la categoría interpretativa (es decir, no cambia si el aislado sería leído como (Fig. 1) (7,8). Para ayudar a resolver este emitir la metodología M27-A2 para Candida ha proporcionado tanto oscila de 24 horas y 48 horas MIC de microdilución para las dos cepas de CC y ocho agentes antifúngicos sistémicos (tabla 2). lo ideal sería que las placas deben ser leídos a las 24 horas cada vez que hay un crecimiento suficiente. El CLSI M27-A2 (1) método es ahora el punto de referencia para validar todos los otros métodos contra. Como resultado de varios sistemas comerciales están ahora disponibles para el laboratorio clínico para las pruebas de susceptibilidad antifúngica. CLSI M44-A estándar para levaduras por difusión en disco: Ver CLSI. Método para antifúngica de difusión con discos pruebas de sensibilidad Las levaduras; Pauta propuesto. documento CLSI M44-A. CLSI, Pennsylvania, EE. UU. 2003. El M44-Una norma es una nueva metodología establecida para la prueba de difusión en disco de especies de Candida. Otros géneros de levaduras y mohos todavía tienen que ser validados mediante este método. La norma incluye los criterios de interpretación de la zona de control de calidad para las gamas de fluconazol y recomendados para fluconazol y voriconazol. Se recomienda el uso de agar Mueller-Hinton suplementado con 2% de glucosa y medio de colorante azul de 0,5 ug / ml de metileno. agar Mueller-Hinton es fácilmente disponible y muestra la reproducibilidad aceptable de lote a lote, la glucosa proporciona una de crecimiento adecuado para la mayoría de las levaduras y la adición de azul de metileno mejora la definición de los bordes de zona. El pH del medio debe estar comprendida entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente después de la gelificación. El inóculo se estandariza a 0,5 McFarland usando un densitómetro y las placas se debe incubar a 35ºC durante 24 horas. Algunas cepas que se ha producido un crecimiento insuficiente después de 24 horas pueden necesitar para ser leído después de 48 horas de incubación. discos de papel preparados comercialmente para fluconazol (25 ug) y voriconazol (1 ug) están disponibles de Oxoid y Becton Dickinson. tamaño de la zona de interpretación y de ingreso mediano equivalentes se han establecido para Candida contra el fluconazol (tabla 3). pruebas de disco son de bajo costo y fácil de configurar y proporcionar una prueba ideal. Sin embargo, se recomienda que todas las cepas resistentes que aparecen deben ser confirmados con el estándar microdilución M27-A2. pruebas de disco puede ser adaptado para su uso con otros hongos incluyendo esporulación moldes pero una vez más los resultados deben ser validados por el método de referencia CLSI apropiado. CLSI M38-A estándar para moldes: Ver CLSI. Método de referencia para la dilución de caldo antifúngica pruebas de sensibilidad hongos filamentosos; Norma aprobada. documento CLSI M38-A. CLSI, Pennsylvania, EE. UU. 2002. El M38-A norma describe un método para las pruebas de sensibilidad antifúngica de los hongos filamentosos (moldes) que causan infecciones invasivas, incluyendo Aspergillus spp. Fusarium spp. Pseudallescheria (Scedosporium) spp. zygomycetes y otros mohos patógenos. Se recomienda el uso medio RPMI-1640 (con glutamina, sin bicarbonato, y con rojo de fenol como indicador de pH) (Sigma # R-7755 St. Louis, EE. UU.) suplementado con 0,2% de glucosa y tamponada a un pH de 7,0 con 0.165 mol / L MOPS (3- [N-morfolino] propanosulfónico) (Sigma # M-6270), como se usa en el estándar M27-A2 para las levaduras. Sin embargo, para los moldes de la preparación del inóculo de las suspensiones de conidios o esporangiosporas debe ser ajustado usando un espectrofotómetro con un inóculo de ensayo en el intervalo 0.4x104 a 5x104 CFU / ml proporcionar los datos de MIC más reproducibles. La densidad óptica (OD) a 530 nm requerido depende del tamaño de conidios o sporangiospores del molde que se está probando; es decir, para Aspergillus y Sporothrix especies la OD = 0,09-0,11; por Fusarium, Pseudallescheria (Scedosporium), y especies de Rhizopus la DO = 0,15 para Bipolaris y Histoplasma especies de la DO = 0,2. Tenga en cuenta la adición de una muy pequeña gota de Tween 20 como agente humectante ayudará a facilitar la preparación de Aspergillus inóculos. Microdilución bandejas se incubaron a 35 ° C; y puede ser leído en 24 horas para especies de Rhizopus; 48 horas para especies de Aspergillus, Fusarium y Sporothrix; y 72 horas más lentas moldes crecimiento como Pseudallescheria especies (Scedosporium). La mayoría de los moldes pueden ser leídos a las 48 horas. Una vez más la turbidez en los pocillos de microdilución debe obtuvo con la ayuda de un espejo de lectura y se comparó con la del control del crecimiento. Una puntuación numérica de 0 a 4 se le da a cada pocillo utilizando la siguiente escala: 0 = ópticamente transparente o ausencia de crecimiento, 1 = leve crecimiento (25% de control del crecimiento), 2 = prominente reducción en el crecimiento (50% de control del crecimiento ), 3 = ligera reducción en el crecimiento (75% de control del crecimiento), 4 = sin reducción en el crecimiento. El MIC para la anfotericina B, itraconazol, voriconazol y posaconazol es la concentración más baja, con una puntuación de 0 (ópticamente transparente). Las CIM para la 5-fluorocitosina, fluconazol y ketoconazol son las concentraciones más bajas con una puntuación de (reducción del crecimiento del 50%) 2 o inferior. Interpretación de los resultados: para puntos finales anfotericina B son bien definida con la mayoría de los moldes de la agrupación entre 0,5 y 2,0 ug / ml. Sin embargo, algunas especies tales como Aspergillus terreus. Acremonium strictum, Pseudallescheria boydii y prolificans Scedosporium muestran MICs más altas en el rango de 2 a 16 ug / ml (aunque se dispone de muy pocos datos, MICs por encima de 2 ug / ml se han asociado con los fracasos del tratamiento). medio RPMI también puede ser poco fiable en la detección de la resistencia a la anfotericina B. Para 5-fluorocitosina mayoría de los micrófonos de molde son mayores de 64 ug / ml, la única excepción son algunas cepas de Aspergillus y los hongos dematiáceos. Del mismo modo para fluconazol mayoría de los micrófonos de molde son mayores de 64 ug / ml, con la única excepción son algunos aislamientos de los hongos dimórficos y dermatofitos. Para itraconazol, voriconazol y posaconazol los puntos finales son normalmente bien definido con los PRM que van desde 0,0313 hasta 16 ug / ml. No hay puntos de interrupción fiables se han publicado los PRM molde y hay muy limitados datos in vivo disponibles en. No hay sistemas comerciales está disponible todavía, aunque algunas placas de levadura como la prueba Sensititre YeastOne se pueden utilizar mediante el ajuste del inóculo a la OD relevante utilizando un espectrofotómetro como se describe anteriormente. densidad de inóculo y los controles de crecimiento son también esenciales. Los principales problemas con moldes de prueba son la estandarización del inóculo, bajas tasas de crecimiento, mohos no productores de esporas y la interpretación de los criterios de valoración. Las pruebas de susceptibilidad antifúngica de moldes es técnicamente más exigente. Los sistemas disponibles en el mercado: Panel de Sensititre® (fabricado por TREK pero suministrado en Australia por Dutec Diagnostics). Este es un método de dilución en caldo de microvaloración basado en la norma CLSI M27-A2 se describe anteriormente. Cada prueba consiste en una placa de microtitulación desechable, que contiene secó diluciones en serie de seis agentes antifúngicos, anfotericina B (intervalo de 0,008 a 16 mg / ml), fluconazol (rango de 0,125 a 256 mg / ml), itraconazol (rango de 0,008 a 16 mg / ml), ketoconazol (rango de 0,008 a 16 mg / ml) y 5-fluorocitosina (rango de 0,03 a 64 mg / ml), voriconazol (rango de 0,008 a 16 mg / ml) en pocillos individuales (Fig.2). Los pozos también contienen Alamar Blue como indicador colorimétrico, lo que mejora en gran medida el punto de legibilidad extremo por un cambio de color de azul a rosa. Los resultados se expresan como una MIC y estudios comparativos contra el método CLSI han mostrado resultados favorables (9,10). En general, el Sensititre® YeastOne es una prueba robusta y reproducible, fácil de configurar, los puntos finales son claramente visibles y los resultados se encuentran dentro del rango esperado (Tabla 4). Cada placa da resultados de CIM para 6 agentes antifúngicos comunes. Excelente vida útil y la prueba también trabaja con moldes, especialmente aquellos que esporular libremente como Aspergillus. Panel de Sensititre® Fungitest0.5 mg / ml 11,12. El Fungitest es fácil de configurar y de los criterios de valoración son claramente visibles. La mayoría de los resultados se encuentran dentro del rango esperado, pero puede ser difícil de detectar cepas resistentes, sobre todo a Fluconazole12. Excelente vida útil, pero todavía no hemos evaluado este de prueba para moldes. Fungitest Etest (fabricado por AB en Suecia y Biodisk suministrado en Australia por el australiano Servicios de Laboratorio Pty Ltd). Este es un método de difusión en agar utilizando una tira con un gradiente de concentración predefinida del agente antimicrobiano está probando. Este gradiente permite una determinación de MIC a realizar. Etests se han utilizado ampliamente para las pruebas de susceptibilidad de las bacterias y que también están disponibles para los agentes antifúngicos, incluyendo anfotericina B (intervalo de 0,002 a 32 mg / ml), ketoconazol (rango de 0,002 a 32 mg / ml), itraconazol (rango de 0,002 a 32 mg / ml), fluconazol (rango de 0,016 a 256 mg / ml), voriconazol (rango de 0,002 a 32 ug / ml) y 5-fluorocitosina (rango de 0,002 a 32 mg / ml) (fig. 3). Las dos dificultades con Etests contra los hongos han sido siempre que el medio a utilizar y con la interpretación del punto final. El problema sigue siendo más tarde, pero ahora se recomienda que modifica agar RPMI-1640 suplementado con 0,2% de glucosa se utiliza de acuerdo con la norma CLSI 13,14,15. Etests son simples de realizar y la metodología es similar a la utilizada en bacteriología. antifúngicos individuales pueden ser probados y no hay correlación razonable con la norma CLSI. puntos finales Etest son a menudo difíciles de leer debido al efecto de arrastre visto con algunas cepas [de aproximadamente 20% de las levaduras (Fig. 4)]. Como resultado del MIC puede tender a ser más altos de lo esperado por lo que es importante repetir ningún resultado en paralelo con una mancha de control oa hacer que se confirmó por otro método. Etest y Neo-Sensitab prueba. Neo-Sensitabs anfotericina B (10 ug), ketoconazol (15 ug), itraconazol (8 ug), fluconazol (25 ug), voriconazol (1,0 ug), 5-fluorocitosina (1 y 10 ug), clotrimazol (10 ug), miconazol (10 ug), econazol (10 ug), natamicina (10 ug) y nistatina (50 ug). Neo-Sensitabs son, pruebas de difusión en agar baratos son fáciles de configurar y mostrar el potencial para el cribado de un gran número de cepas de resistencia. Sin embargo, el tamaño de la zona de disco individuo a menudo no son capaces de diferenciar entre los aislamientos dependiente de la dosis susceptibles y sensibles, así como la correlación entre el tamaño de la zona y el MIC es más variable10. Una vez más, los aislados resistentes deben ser confirmados mediante el uso de una de la metodología apropiada CLSI. Consejos del banco. Levaduras (Candida y Cryptococcus) Subcultivo en agar de dextrosa Sabourauds e incubar durante 24-48 horas a 35OC para obtener un cultivo puro recién crecido. Use un hisopo con punta de algodón estéril para cosechar colonias y mezclar bien para asegurar una suspensión homogénea (no hay células agrupadas). Moldes Sub-cultura de la patata dextrosa agar pistas e incubar durante 7 días a 35 ° C para la mayoría de los moldes, excepto por Fusarium spp. los cuales deben incubarse durante 2 días a 35 ° C luego 5 días a 25 ° C) para garantizar la máxima esporulación (tiempos de incubación más cortos pueden ser utilizados si se requiere con urgencia resultados teniendo en cuenta la necesidad de un número suficiente de conidios a la cosecha). Usar una pipeta de parche estéril para lavar suavemente la superficie de la colonia con agua destilada estéril o solución salina (para Aspergillus use 1 gota de Tween 20 como agente humectante para ayudar a dispersar los conidios). Para hongos filamentosos, que no esporulan profusamente, añadir una gota de agente humectante Tween 20 al agua destilada estéril y luego rompen el molde por agitación con pequeñas perlas de vidrio para hacer una suspensión adecuada. Dejar que la suspensión en reposo durante unos minutos para que los segmentos de hifas más grandes tienen tiempo para asentarse, a continuación, utilizar la parte superior capa homogénea para obtener la densidad de inóculo deseado. Siempre se debe mezclar, combinar y mezclar para asegurar células de levadura o conidios se distribuyen uniformemente a través de la suspensión. Utilizar una pipeta multicanal. Esto es importante para lograr una distribución uniforme del inoculo, evitando saltado pozos y para reducir las burbujas de aire. Incubar bandejas en cámara húmeda si no sellado. Siempre compare con el control del crecimiento y, si no está seguro de qué anotar, buscar el punto final también. pozos omitidos pueden ocurrir debido a (a) inóculo incompatible dispensado en los pocillos, (b) hábito pobre crecimiento de organismo, y (c) un error de fabricación cuando el fármaco como dispensada en los pocillos. Repita la prueba si 2 o más pozos omitidos están presentes. Para aislamientos de arrastre comprobar la densidad de inóculo, repetir la prueba y se leyó a las 24 horas. En caso de duda, o el resultado es inesperado y repita la prueba. Conclusión: Las principales dificultades prácticas con sensibilidad a los antifúngicos son por lo general con la determinación de la preparación del inóculo y el punto final. Un inóculo y la esterilidad de verificación de densidad se debe hacer para cada prueba [es decir, extendido 100 ml del inóculo en una placa de SDA limpio y contar el UFC en 24 horas]. Esto también actúa como un control de crecimiento para hongos que crecen más lentos [es decir, puede que tenga que leer algunas placas a las 48 ó 72 horas]. Si el inóculo es demasiado ligero o pesado de la prueba debe repetirse. lectura de punto final también se puede mejorar mediante el uso de indicadores colorimétricos, lectores de placas y lectores de zona automatizados, que permiten un resultado más cuantitativo. Nadie prueba es a toda prueba, si los resultados no son los esperados, el ensayo debe repetirse para su confirmación. En conclusión, estamos en una etapa emocionante en el desarrollo de ensayos in vitro de sensibilidad antifúngica y sistemas están ahora disponibles que permiten que el laboratorio clínico para llevar a cabo estas pruebas con cierta confianza. Sin embargo quedan muchas cuestiones. No hace falta decir que se necesita una cultura, que no siempre es posible. La identidad de la cultura a menudo es predictiva de la susceptibilidad in vitro, por lo que aísla debe ser probado? Sólo aquellos clínicamente justificado o si la pantalla todos los aislamientos de laboratorio? (Microscopía, cultivo y antibiograma) no es una opción viable en micología médica. En muchos casos, la relevancia clínica de los resultados de sensibilidad antifúngica in vitro sigue siendo difícil de interpretar y consejo experto de un microbiólogo o consultoría especialista en enfermedades infecciosas puede ser requerida. CLSI. Método de referencia para la dilución de caldo antifúngica pruebas de sensibilidad Las levaduras; El estándar de aprobación-Segunda edición. documento CLSI M27-A2 [ISBN 1-56238-469-4]. CLSI, Pennsylvania, EE. UU. 2002. CLSI. Método para antifúngica de difusión con discos pruebas de sensibilidad Las levaduras; Pauta propuesto. documento CLSI M44-P [ISBN 1-56238-488-0]. CLSI, Pennsylvania, EE. UU. 2003. CLSI. Método de referencia para la dilución de caldo antifúngica pruebas de sensibilidad hongos filamentosos; Norma aprobada. CLSI documento M38-A [ISBN 1-56238-470-8]. CLSI, Pennsylvania, EE. UU. 2002. Rex JH, Pfaller MA, Galgiani JN et al. (1997). El desarrollo de los puntos de interrupción de interpretación para las pruebas de sensibilidad antifúngica; marco conceptual y el análisis de los datos in vitro in vivo de correlación para fluconazol, itraconazol y las infecciones por Candida. Clin Infect Dis. 24: 235-47. Witt MD, Lewis RJ, Larsen RA, et al. (1996). La identificación de los pacientes con meningitis criptocócica agudas asociadas con el SIDA que se pueden tratar eficazmente con fluconazol: El papel de las pruebas de sensibilidad antifúngica. Clin Infect Dis. 22: 322-328. Arthington-BA Skaggs, Warnock DW, Morrison CJ. (2000. La cuantificación de la Candida albicans contenido ergosterol mejora la correlación entre los resultados de las pruebas de susceptibilidad antifúngica in vitro y los resultados in vivo después del tratamiento fluconazol en un modelo murino de candidiasis invasiva Antimicrob Agents Chemother 44:.. 2081-2085. Pfaller M. 2002. Centrarse en las infecciones fúngicas 12, Phoenix Arizona marzo de 2002. La candidemia australiana Estudio de actualización de junio de 2004. Espinel-Ingroff A, Pfaller M, Messer SA. et al. (1999). comparación multicéntrico del panel antifúngico colorimétrico Sensititre® YeastOne con el Comité Nacional para A-M27 método clínico Normas de Laboratorio de referencia para las pruebas de aislamientos clínicos de común y emergentes Candida spp. Cryptococcus spp. y otras levaduras y organismos similares a las levaduras. J Clin Micro. 37: 591-595. Ellis DH. Et. Alabama. 1999. Evaluación del panel de microtitulación Sensititre® YeastOne, Etest y métodos de disco Neo-sensitab para las pruebas de sensibilidad antifúngica contra 4 levaduras de referencia. Resumen MP3.24 9 de IUMS Congreso Internacional de Micología, Sydney, agosto de 1999. Swinne D, Raes-Wuytack C, Van Looveren K, Desmet P. (1999). Evaluación comparativa de Fungitest, Neo-Sensitabs y M27T-CLSI métodos de microdilución en caldo para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos antifúngicos de especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Micosis 42: 231-237. Witthuhn F, Toubas D, Beguinot I. et al (1999). Evaluación del kit fungitest mediante el uso de cepas de pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana: estudio de la sensibilidad a los medicamentos de azol. J Clin Micro. 37: 864-6. Guía técnica Etest 4b AB Biodisk, Suecia. Chen CA, ODonnell ML, Gordon S, Gilbert GL. (1996). las pruebas de susceptibilidad antifúngica utilizando Etest: comparación con la técnica de macrodilución de caldo. J Antimicrob Chemo. 37: 265-73. Arikan S, D Gur, Akova M. (1997). La comparación de Etest, microdilución y dilución colorimétrico con el método de macrodilución caldo de referencia para las pruebas de sensibilidad antifúngica de especies de importancia clínica de Candida aisladas de pacientes inmunocomprometidos. Micosis 40: 291-296. Meis, MGF, M. Petrou, J. Bille, D. Ellis, D. Gibbs y el antifúngico Grupo Mundial de Vigilancia. 2000. Una evaluación global de la susceptibilidad de las especies de Candida al fluconazol por difusión con discos. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 36: 215-223. Barry, A. L. et al. 2000. Los límites de control de calidad para las pruebas de susceptibilidad de microdilución en caldo de diez agentes antifúngicos. J. Clin Micro. 38: 3.457-3459.